Manipulación y Almacenamiento de péptidos sintéticos
Muchas veces el aspecto más difícil de trabajar con péptidos sintéticos es determinar el mejor disolvente en el que el péptido se disolverá. Este documento debe servir como una guía general para el correcto almacenamiento, la manipulación y la disolución de su péptido sintético.
Directrices de almacenamiento para liofilizadas Péptidos
Al recibir el péptido liofilizado, almacene a 4 ℃ o más frío y alejado de la luz brillante. Péptidos liofilizados son estables a temperatura ambiente durante días o semanas, pero para el almacenamiento a largo plazo, es más seguro para almacenar a -20 ° ℃ o más frío.
Una estrategia para disolver los péptidos individuales
No hay solvente universal para solubilizar todos los péptidos liofilizados, mientras que también mantiene su integridad y compatibilidad en ensayos biológicos. Diferentes disolventes pueden necesitar ser probado hasta un disolvente apropiado se encuentra Seleccionar el mejor disolvente para su péptido particular puede ser el resultado de un proceso de "ensayo y error". Siempre que sea aplicable, es aconsejable tratar primero disolventes que son relativamente fáciles de eliminar por yophilization, en caso de que el disolvente inicial no funciona. Por lo tanto, es necesario probar una porción del péptido primero antes de disolver toda la muestra de péptido. Los pasos siguientes proporcionan una guía general para la solubilización de péptidos.
La determinación de las características de solubilidad
Antes de añadir cualquier disolvente al péptido liofilizado, es importante para evaluar el aminoácido
composición del péptido como una herramienta preliminar en la comprensión de las características de solubilidad de su péptido. El número y tipos de cargas iónicas en el péptido determinar su solubilidad en soluciones acuosas. En general, los residuos más cargadas del péptido posee, más soluble es en soluciones acuosas. Además, los péptidos tienen generalmente más cargos a pH 6-8 que a pH 2-6. Es por esta razón que los péptidos se disuelven mejor a pH casi neutro. Entre las muchas excepciones a la regla son secuencias de péptidos que son muy hidrofóbica y los que tienden a agregarse. Mientras que la hidrofobicidad de la secuencia es la causa primaria de la agregación, los péptidos también pueden agregar o "gel" a través de la extensa red de enlaces de hidrógeno. Las siguientes pautas se utilizan para determinar si el péptido es básico, ácido o neutro.
1. Asignar un valor de -1 a cada residuo ácido (D, E, y C-terminal COOH)
2. Asignar un valor de 1 a cada residuo básico (K, R y el N-terminal NH2)
3. Asignar un valor de 1 para cada residuo H a pH <6 y cero a pH> 6.
4. Contar el número total de cargas del péptido a pH 7 (todo D, E, K, R, C-terminal COOH, y C-terminal NH2).
5.Calculate la carga neta global del péptido.
Disolver Enfoque para péptidos cargados
Basado en las pautas anteriores, proceda a comprobar la solubilidad del péptido usando las siguientes estrategias:
1. Si la carga neta global del péptido es negativo, el péptido se considera ácida. Si el péptido es ácida, y / o si el número total de cargas del péptido a pH 7 es mayor que 25% del número total de residuos, añadir una pequeña cantidad de bicarbonato de amonio 0,1 M para disolver el péptido y diluirlo con agua hasta la concentración deseada. Asegúrese de que el pH resultante de la solución de péptido es de aproximadamente 7 y ajustar el pH según sea necesario.
2. Si la carga neta global del péptido es positiva, el péptido se considera básica. Si el péptido es básico y el número total de cargas del péptido a pH 7 se encuentra entre 10-25% del número total de residuos, añadir una pequeña cantidad de ácido acético 25% para disolver el péptido y diluirlo con agua hasta la concentración deseada.
3. Si la carga neta global del péptido es cero, el péptido se considera neutral. Si el número total de cargas es mayor que 25% del número total de residuos, utilizar la estrategia describedin sección 1. Si el número total de cargas es de entre 10-25% del número total de residuos, usar disolventes orgánicos como se recomienda en otra parte en este documento.
4. Si el número total de cargas del péptido es menor que 10% del número total de residuos, el uso de disolventes orgánicos es recommended.For cualquier disolvente utilizado, la concentración máxima del disolvente inicial dependerá de la tolerancia de su ensayo contra ese disolvente particular. Antes de intentar disolventes fuertes, es necesario para sonicar la solución de péptido para confirmar que el péptido es insoluble en el disolvente. La sonicación mejora la solubilización, rompiendo el péptido sólido en partículas más pequeñas. Si, después de la sonicación, la solución ha gelificado, aparece turbia o tiene partículas visibles, el péptido no se haya disuelto por completo, pero se suspende. En este punto, un disolvente fuerte es necesario. Si el péptido no se disuelve, liofilizar y eliminar la solución tampón volátil. Una vez que la muestra está seca, disolventes alternativos pueden ser juzgados en la misma muestra.
Disolver Enfoque para péptidos hidrófobos / sin carga
Las recomendaciones anteriores sobre la base de la naturaleza cargada de péptido probablemente serán inadecuados para la disolución de los péptidos que contienen más de un 50% de residuos hidrofóbicos en su secuencia, péptidos neutros, con menos del 25% de cargas y / o péptidos que tiene menos de 10 cargos%. Bajo estas condiciones, se recomienda el uso de disolventes orgánicos, tales como acetonitrilo (ACN), dimetilsulfóxido (DMSO), o dimetilformamida (DMF). La adición de compuestos caotrópicos tales como hidrocloruro de guanidina o urea puede facilitar en romper interacciones hidrofóbicas o reducir la "gelificación" de péptidos mediante la interrupción de la red de enlaces de hidrógeno. Una vez más, la concentración del disolvente o caotrópicos reactivos orgánicos iniciales dependerá de la tolerancia de su sistema de ensayo. Tenga en cuenta también que las secuencias de péptidos que contienen Cys (C) y Met (M) son inestables en DMSO.
Es importante para disolver el péptido completamente en el disolvente inicial (tal como ácido acético, acetonitrilo, DMSO o DMF) porque la tasa de disolución de los péptidos en estos disolventes es por lo general mayor que en una mezcla de agua / disolvente. Si la mezcla de agua / disolvente se utilizó por primera vez para disolver el péptido, que puede terminar la adición de una cantidad mucho mayor que la necesaria cantidad de disolvente no acuoso para su muestra de péptidos. La sonicación también puede ser necesario para facilitar la disolución completa del péptido.
Después de que el péptido se disuelve en el disolvente inicial, especialmente aquellos disuelto en disolventes orgánicos, se diluye el péptido añadiendo lentamente (gota a gota) la solución de péptido en la solución tamponada con suave pero constante agitación. Esto es para evitar una concentración localizada del péptido en la solución acuosa, que potencialmente puede dar lugar a la precipitación del péptido. El beneficio añadido de esta estrategia es que la posibilidad de precipitación se puede controlar visualmente y actuar en consecuencia en consecuencia.
Preparar una solución madre de Trabajo (Enfoque general)
Hacer una solución madre que está a una concentración mayor que la requerida para el ensayo experimental disolviendo el péptido en agua destilada estéril o estéril diluida de ácido acético (0,1%), en su caso. El péptido solución madre puede diluirse más con el tampón de ensayo. Si el tampón de ensayo se utiliza inicialmente para disolver el péptido y no se disuelve, la recuperación del péptido, libre de sales no volátiles y / o disolventes orgánicos puede ser un desafío. Si el péptido no se disuelve en agua o en ácido acético, la solución de péptido se puede liofilizar sin residuos no volátiles. Una vez que el péptido es liofilizada, otros disolventes fuertes pueden ser juzgados.
Directrices para la disolución de varios péptidos
Una estrategia recomendada para redisolver conjuntos de péptidos que contienen propiedades variables se describe a continuación. Este procedimiento puede dar con la solución madre de trabajo final de cada péptido que posee diferentes niveles de volumen.
1. Añadir 0,1% de ácido acético / agua para dar una concentración objetivo de 1-5mg / mL y sonicar la muestra.
2. Para cualquier péptidos insolubles añadir ácido acético puro para llevar la concentración del ácido acético a 10% (v / v), y someter a ultrasonidos la muestra.
3. Si los péptidos son todavía insoluble, añadir acetonitrilo al 20% (v / v), y someter a ultrasonidos la muestra.
4.Lyophilize cualquier péptidos insolubles restantes para eliminar el agua, ácido acético y acetonitrilo. Cuando la muestra está completamente seco, añadir DMF puro o DMSO (gota a gota) hasta que se disuelva peptídicos. Diluir lentamente la solución con agua hasta aproximadamente 10% (v / v) DMF o DMSO. Si la precipitación ocurre en cualquier etapa durante este paso, dejar de añadir agua y añadir más DMF o DMSO (gota a gota) hasta que el péptido se disuelve completamente. Estos péptidos pueden ser demasiado insoluble en agua para ser utilizado en la misma concentración de los otros en el conjunto.
5.Dilute cada péptido solubilizado con el disolvente más eficaz para llevar las soluciones madre a la misma concentración de péptido. Esto simplificará el trabajo con los péptidos en el ensayo experimental. Diluciones adicionales pueden ser hechas en el tampón de ensayo. La dilución de los péptidos insolubles con tampón a este paso puede eliminar la ocurrencia de precipitación, ya que es ahora por debajo de su límite de solubilidad.
Soluciones 6.All, excepto los que contengan DMF o DMSO, se pueden liofilizar. Esto devolverá el péptido a un estado adecuado para el almacenamiento óptimo a largo plazo.
Directrices de almacenamiento para soluciones de péptidos
La vida útil de las soluciones de péptidos es limitado. Los péptidos que contienen N, Q, C, M y W son inestables
cuando se almacena en solución. El uso de tampones estériles (pH 5-6) y la congelación de las alícuotas prolongará thestorage vida del péptido. El almacenamiento a -20 ℃ o más fríos es óptima. Evite congelamientos thawcycles repetidas, ya que esto puede degradar los péptidos.
Estabilidad de Péptidos y vías de degradación potenciales
La estabilidad de los péptidos varía con la composición de aminoácidos. Un péptido puede degradarse si
no se utilizan las condiciones de almacenamiento apropiadas. Además del riesgo de degradación de
enzimas proteolíticas, pueden producirse otros cambios químicos. La siguiente sección describe algunas
posibles vías de degradación que pueden surgir.
1. Hidrólisis - Este es generalmente un problema en péptidos que contienen Asp (D) en la secuencia, que es susceptible a la deshidratación para formar una imida cíclica intermedia. Si la secuencia contiene Asp-Pro (DP), el ácido catalizada formación de imida cíclica intermedia puede dar lugar a la escisión de la
cadena peptídica. Del mismo modo, si Asp-Gly (DG) está presente en la secuencia, el canbe intermedio cíclico hidroliza ya sea en la forma original Asp, que es inofensivo, o en un análogo potencialmente inactiveiso-aspartato. Eventualmente, todos de la forma de aspartato puede ser completamente convertidos en theiso-aspartato analógica. En menor medida, las secuencias que contienen Ser (S) también pueden formar imideintermediate cíclico que puede resultar en la escisión de la cadena peptídica.
2. La desamidación - Esta reacción catalizada por base se produce en secuencias que contienen Asn-Gly (NG) o
Gln-Gly (QG) y sigue un mecanismo análogo a la secuencia (DG) Asp-Gly. La desamidación (pérdida de amina) de la secuencia Asn-Gly forma una imida cíclica intermedio que luego es hidrolizado para formar el aspartato o iso-aspartato análogo de Asn. Además, la imida cíclica intermedia puede conducir a la racemización en D-Asp o D-iso-Asp análogos de Asn, todos que potencialmente puede haber formas inactivas.
3. Oxidación - El Cys (C) y Met (M) los residuos son los residuos predominantes que se someten a
oxidación reversible. La oxidación de la cisteína se acelera a pH más alto, donde el tiol es más
fácilmente desprotona y forma fácilmente dentro de la cadena o enlaces disulfuro entre cadenas. Los enlaces disulfuro puede invertirse fácilmente por tratamiento con ditiotreitol (DTT) o tris (2-carboxietilfosfina)
clorhidrato (TCEP). La metionina se oxida por ambas vías químicas y fotoquímicas a formar sufoxide metionina y más en metionina sulfona, ambos de los cuales son casi imposible de revertir.
4. dicetopiperazina y la formación de ácido piroglutámico - formación de dicetopiperazina se produce cuando
Gly (G) está en la tercera posición desde el extremo N-terminal, y más fácilmente si Pro (P) o Gly (G) es En posición 1 o 2. La reacción implica el ataque nucleofílico del nitrógeno N-terminal en el
carbonilo de la amida entre el segundo y el tercer aminoácido, que conduce a la escisión de la
primero dos aminoácidos en la forma de una dicetopiperazina. Por otro lado, el ácido piroglutámico
la formación es casi inevitable si Gln (Q) está en la posición N-terminal de la secuencia. Esta es la reacción ananalogous donde los ataques de nitrógeno N-terminal del carbonilo de carbono de la cadena lateral de Glu
(Q) para formar un análogo de péptido pyroglutamayl desaminado. Esta conversión también se produce en el péptido
que contiene Asn en el N-terminal, pero en un grado mucho menor.
La forma más eficaz de prevenir o minimizar la degradación del péptido es almacenar el péptido en forma yophilized a -20 ℃ o preferiblemente a -80 ℃ (si está disponible). Si el péptido está en solución, los ciclos freezethaw deben evitarse por congelación partes alícuotas individuales. La exposición a pH> 8 debe ser evitado. Sin embargo, si es necesario para disolver los péptidos a pH> 8, las soluciones deben ser refrigerados. Finalmente, la exposición prolongada de péptidos y soluciones (especialmente a pH alto) al oxígeno atmosférico liofilizadas debe ser minimizado.
